Free Radical Biology and Medicine︱溫醫大眼視光麻曉銀教授/侯陵教授團隊最新發現：MITF通過調控線粒體融合為視網膜 “保駕護航”
視網膜是人類認識世界的重要窗口，其中，視網膜色素上皮細胞（RPE）是其重要 “守護者”。RPE細胞功能異常可引發視網膜變性，進而導致不可逆的視力損傷乃至失明。近日，溫州醫科大學附屬眼視光醫院眼發育細胞生物學與疾病研究組（麻曉銀/侯陵）團隊在Free Radical Biology and Medicine （Top期刊、IF: 8.2）雜志發表題為“MITF promotes MFN2-dependent mitochondrial fusion to protect retinal pigment epithelial cells from mitochondrial damage”的研究論文，該研究聚焦視網膜色素上皮（RPE）細胞的線粒體穩態，證明了小眼畸形轉錄因子（MITF）通過促進 MFN2 依賴的線粒體融合，加深了對線粒體融合-分裂調控機制的認識， 為 RPE 細胞“護航”抵御線粒體損傷和視網膜退行性疾病的防治提供了新的思考和實驗數據支持。
為了研究MITF在視網膜色素上皮（RPE）細胞線粒體調節中的功能作用，團隊通過體內體外實驗進行多層級驗證。在動物實驗中，透射電鏡顯示 MITF 過表達轉基因小鼠（Dct-Mitf）的 RPE 細胞線粒體長寬比顯著高于野生型，而 MITF 雜合子小鼠（Mitf-/+）線粒體長寬比和平均線粒體網絡均低于野生型，呈碎片化狀態（圖1A-C）；在小鼠原代 RPE 細胞中，經 MitoTracker 染色后共聚焦成像進一步證實，Dct-Mitf小鼠線粒體長度、網絡規模和長寬比更大，Mitf-/+小鼠則相反（圖1D-G）；在人源ARPE-19細胞通過pDsRed2-Mito標示線粒體病證實高表達MITF細胞中線粒體多為融合和伸長的形態，平均長度更長，平均線粒體網絡更多，長寬比更大（圖1H-N）。以上結果表明MITF 參與 RPE 細胞線粒體形態調節，并促進RPE細胞的線粒體融合。
圖1 MITF 促進 RPE 細胞線粒體融合
之后，研究者通過敲低實驗反向驗證 MITF對線粒體形態的必要性。使用Mito-COX8-GFP標記線粒體使其自帶綠色熒光。在小鼠原代RPE細胞和ARPE-19細胞中研究證實干擾MITF表達可促進線粒體碎片化（圖2），提示MITF在線粒體形態和線粒體融合的調節中起關鍵作用。
圖2 干擾 MITF后RPE細胞線粒體碎片化增加
為了進一步研究MITF對于線粒體功能的影響，研究者使用線粒體電子傳遞鏈解偶聯劑CCCP誘導RPE細胞線粒體損傷。結果表明RPE細胞中高表達MITF能夠保護RPE細胞抵御CCCP誘導引起的線粒體損傷（圖3）和細胞死亡（圖4）。
圖3 過表達 MITF 抵御 CCCP 誘導的線粒體損傷。
圖4 過表達MITF保護CCCP誘導線粒體損傷后的RPE細胞
在機制研究中，研究者通過染色體免疫共沉淀（ChIP）、雙熒光素酶報告實驗等研究手段，揭示了MITF通過直接結合到MFN2基因啟動子區域、轉錄起始位點上游671位的E-box結合位點（CATGTG）并激活MFN2的表達，對該結合位點進行突變之后（TGCACA）則失去對其轉錄調控能力（圖5）。
圖5 MITF通過與MFN2的啟動子區域結合，直接調控MFN2的表達
為了進一步在體研究MITF保護RPE/視網膜抵御線粒體損傷的作用，研究人員對小鼠玻璃體腔進行注射 CCCP 72 小時后，通過眼底彩照、視網膜切片HE染色、RPE細胞鋪片染色等研究手段證實在相同CCCP處理情況下，MITF低表達小鼠RPE/視網膜損傷加重，而高表達MITF則能保護RPE/視網膜損傷抵御CCCP誘導的線粒體損傷，提示在體 MITF 表達增加對 RPE 存在保護作用，有助于抵御線粒體損傷引起的視網膜受損。
圖6 過表達 MITF在體保護CCCP誘導損傷后視網膜結構
由于MITF在視網膜的RPE細胞中特異性表達，研究人員進一步利用RPE特異性 RPE65 啟動子構建AAV9-MITF表達載體，在小鼠中進行視網膜下注射AAV9病毒，免疫熒光證實 MITF 上調（圖7A）；CCCP 誘導損傷后，AAV9-MITF 組眼底損傷面積顯著小于對照（圖7C-D），H&E 染色和 RPE 鋪片顯示其 RPE 細胞結構和連接更完整（圖 7B-E），證明RPE細胞特異性高表達MITF能夠有效保護視網膜抵御CCCP誘導的損傷。
圖7 AAV介導的RPE特異性MITF過表達可保護RPE免受CCCP誘導的線粒體損傷
最后，研究者又采用線粒體靶向抗氧化劑SkQ-1 納米顆粒（SkQ-1 NP）并將其應用于Mitf-/+小鼠在CCCP誘導引起的視網膜損傷的干預研究。結果證實治療組視網膜損傷面積僅為對照組的 1/3，并且其RPE細胞連接更完整，結構損傷更輕（圖8），表明線粒體靶向抗氧化劑可作為 MITF 功能缺陷的替代治療方案。
圖8線粒體靶向的SKQ-1納米顆粒治療CCCP誘導的Mitf? /+小鼠RPE損傷。
總結與展望
本研究闡明MITF 通過直接結合 MFN2 啟動子并激活其轉錄，促進 RPE 細胞的線粒體融合，從而增強 RPE /視網膜抵御線粒體損傷的能力；SkQ-1 NP可在Mitf 單倍劑量不足小鼠上緩解CCCP誘導的 RPE /視網膜損傷。后續研究可進一步探索MITF調控其他影響線粒體動態平衡（如線粒體自噬、分裂等）或其他細胞過程的機制；此外，在臨床轉化層面，可通過優化線粒體靶向藥物 SkQ-1 納米顆粒的遞送方式，并開發針對 MITF-MFN2 通路的藥物，進一步挖掘其治療相關疾病的潛力，推動研究成果向臨床轉化。
溫州醫科大學附屬眼視光醫院眼發育細胞生物學與疾病研究組研究生陳迎澳、盧婉妮、李平平是論文的共同第一作者。麻曉銀研究員、侯陵研究員是該論文的共同通訊作者。該工作得到了溫州醫科大學眼視光醫院國家工程中心林森副研究員、視覺健康全國重點實驗室高美玲副研究員的大力支持；得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金的經費資助。
